Forholdsregler for polyakrylamidgelelektroforese

· polyakrylamidGelen må blandes med akrylamidmonomer, polymerisasjonsutgangsmateriale, katalysator og salt og bufferblanding.

· akrylamidog BIS (N,N'-metylen-dobbeltakrylamid) er monomerformen i gelmatrise.

· ammoniumpersulfat-startpolymerisasjonsprosess for lim. Formuleringen av limet krever 10 % ammoniumpersulfatløsning tilberedt i vann. Det meste av informasjonen indikerte behov for aktiv bruk. Imidlertid kan 10 %-løsningen plasseres ved 4 ℃ i flere uker uten betydelig tap av aktivitet. Fyll opp til 10 ml og kast når limet ikke aggregerer.

Tips: Prosentandelen avakrylamidI sekvensering er ikke lim og proteinlim det samme. Hvis du bruker en ferdiglaget akrylamid-BIS-løsning, må du sørge for å få riktig flaske.

· TEMED (N, N, N', N'-tetrametyletylendiamin) er en katalysator i en brun flaske som plasseres i kjøleskapet. Tilsett rett før du heller limet.

· Polyakrylamidelektroforeseglass som brukes i elektroforese bør vaskes før og etter hver elektroforese. Etter elektroforese, vask med en myk børste og klut i varmt såpevann, skyll med destillert vann og la det tørke.

· Fuktighet og støv kan forårsake irritasjon med hul polymer. Før elektroforese, rengjør glassplaten med glassrens og tørk av med en myk børste. Vask med destillert vann og tørk grundig med en papirserviett. Skylling med 70 % etanol før du tørker av med papir bidrar til rengjøring og fremskynder tørkingen. Tilsett prøver av akrylamid suksessivt: BIS, vann, bufferløsning, ammoniumpersulfat, TEMED. Rist godt og hell umiddelbart.

Det er ikke nødvendig å avgasser polyakrylamid før polymerisasjon. (Akrylamid ble tidligere plassert i vakuum for å fjerne bobler fordi oksygen hemmer polymerisasjon.)

Eksempelspisser for horisontale limpunkter.

· Legg et svart papirark i den nederste esken, med svart bakgrunn for å lage et hull i prøven slik at du kan se tydeligere.
· buffer fylt med limtank, rett over kolloiden.
· Hvis kanten har et lys, slå på lysene og la lyset skinne kolloidalt. Trekk prøven opp i pipetten.
· bruk av automatisk pipetteringsenhet.
· I 10–200 μ1 kan et væskeflytpunkt brukes i de fleste punktene på prøven. For svært små prøvehull (mindre enn 10μ1) er det mer praktisk med et langt pipettehode som brukes til sekvenseringslim.

· pipettering som bare er nedsenket i prøven, inhalering av saktegående væske. Prøven kan virke klissete med glyserin, og rask pumping kan trekke luftbobler inn i pipettehodet.

· Etter innånding av prøvene, vil pipettehodet bevege væskehodet forsiktig langs kanten av røret, eller tørkepapiret vil suge væskehodet utenfor dråpene. Vær forsiktig så du ikke suger inn prøven.

Plasser prøven i prøvehullet

· pipetteringsenhet for å opprettholde et lite trykk, få prøvene til å bevege seg litt mens overløpsvæskehodet.
· pipettehodet som settes inn i bufferen, litt høyere enn punkthullene, opprettholder positivt trykk. Pipettespissen kan settes inn i et lite hull.
· sakte og jevnt føre prøvene ut. Pipettespissen plasseres over det punktvise prøvehullet, og prøven vil synke ned i hullet. La prøven synke for å fylle prøvehullet i stedet for å presse den inn.
· Når den siste dråpen av prøven med væskehode er kommet, vil væsken bevege seg til det andre benet, hev væsken sakte og bevege seg ut av bufferen.

Hvordan utføre vertikal limprøvetaking?

· vertikale limhull i prøven dannet mellom to glassbiter. I veldig tynt lim kan ikke engang pipettehodet settes inn mellom to glassplater. Pass på glyserinen! Plasser pipettehodet over prøvehullet, så vil prøven synke ned i hullet.
· Før du setter punktprøven, sørg for at den vertikale punktet på polypropylen acylgel-prøvehullet skylles rent. Vask bort upolymerisert akrylamid og vannet som kan vises i bunnen av prøvehullet. Vannet kan gjøre prøvehullet betydelig mindre. Bruk en 25 ml eller 50 ml sprøyte og en 18-gauge nål. Hell i elektroforesebufferen og skyll prøvehullet forsiktig.
· Det kan være vanskelig å se hullet i prøven, men resten er likevel enkelt. Hvis det er for mange hull, kan prøvebufferen testes med bromfenolblått.